TaqMan One-Step Nested PCR解决方案-新海基因—



诊断试剂专题 PCR产品专题 RNA研究专题 miRNA检测专题克隆研究专题蛋白相关专题核酸酶专题核酸修饰酶专题核酸纯化专题细胞相关专题

HaiGene创新性技术平台----超敏TaqMan One-Step Nested PCR法

——————超越传统TaqMan PCR，卓越的灵敏度

产品编号	产品名称	规格	价格(元)
A2270	超敏巢式荧光PCR核酸检测试剂盒开发服务	套	询价
A2270-01	SD 2.0 DNA Polymerase	200T（25 µl 体系）	2,450
A2270-02	SD 3.0 DNA/RNA Polymerase	200T（25 µl 体系）	2,450
A2270-03	FAM Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-03	FAM Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-04	HEX Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-04	HEX Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-05	ROX Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-05	ROX Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-05	Cy5 Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-05	Cy5 Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A227018	超敏双重非洲猪瘟巢式荧光PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	2,750
A227019	超敏新冠D614G分型巢式荧光RT-PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	5,500
A227018	超敏三重新冠巢式荧光RT-PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	3,750

一、TaqMan One-Step Nested PCR核酸扩增技术的原理

巢式PCR具有很高的灵敏度和特异性，但传统的巢式PCR采用两对引物，通过两轮PCR，进行目标产物的扩增。即，采用一对外侧引物进行第一轮扩增，之后再用一对内侧引物以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增。由于传统巢式PCR需要两步扩增，这种操作的不便性，使得其高灵敏度的特性难以应用到临床诊断中。在单管巢式PCR的扩增中，由于内侧引物会阻碍外侧引物的扩增，因此标准的Taq DNA聚合酶不能在单管巢式PCR的扩增中，发挥其高灵敏度的特性。仅有采用耐高温、且具有链置换活性的聚合酶（SD Polymerase），才能保证在单管反应中，内外两侧引物同时扩增，达到巢式PCR高灵敏的特性。
在标准PCR过程中，使用上游和下游两条引物对靶基因进行热循环扩增，每经过一个循环的扩增，产物最多变为2倍。而在One-Step Nested PCR(或称为PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的扩增中由于使用两条上游引物和两条下游引物，因此在每次热循环过程中，产物增加近4倍，在经过30-40次循环后，核酸产物将会高于PCR法成千上万倍，并且所需的循环数更少。在核酸检测的实验中，One-Step Nested PCR法比标准PCR法灵敏度要高10-100倍，并且更容易开发出高灵敏的检测试剂盒。

图1: One-Step Nested PCR工作流程的便利性		图2：One-Step Nested PCR法的高灵敏度原理

传统的巢式PCR采用2次PCR扩增，而One Step Nested PCR法单管一步完成，更利于使用。		标准PCR扩增，在一个热循环后，最多由1分子DNA变为2分子（倍增为2n，n=循环数）。而在采用4引物的One-Step Nested PCR扩增反应中，每经过一次热循环扩增，最多由1分子DNA变为4分子（倍增为4n）。

二、HaiGene的TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术

一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技术最早报道于2013年，虽然其拥有高灵敏度的检测特性，但始终未能在核酸检测领域获得广泛应用。其主要原因是SD聚合酶的链置换活性过于强烈，而导致外切酶活性作用的机会太弱，导致高信噪比的TaqMan探针无法应用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的荧光探针检测只能依靠特异性和信噪比欠佳的发卡FRET探针。HaiGene凭借在分子工具酶改造工作中积累的的丰富经验，开发出具有探针切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，结合独有的P-Bond锚定探针技术，将高信噪比的TaqMan探针应用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested PCR方法。运用TaqMan One-Step Nested PCR方法检测DNA或RNA分子，在检测灵敏度和扩增速度方面，都是传统TaqMan PCR法难以企及的。对于下游用户来讲，TaqMan One-Step Nested PCR在试剂配制、反应程序、所需设备等各个方面，几乎完全一致，不存在任何操作变化的屏障。因此，不论对于实力强劲的大型基因公司继续巩固现有市场，还是对于起步发展阶段的中小型基因公司抢占市场份额，TaqMan One-Step Nested PCR技术都将是未来基因检测市场争夺战中的最有利武器。

表1 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能对比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物数	两条	四条或六条
探针	双标荧光探针	双标P-Bond荧光探针
热循环倍增数	<2	>2
扩增条件	热变性循环	热变性循环
检测设备	标准定量PCR仪	标准定量PCR仪
数据判读方式	扩增曲线或Ct值	扩增曲线或Ct值
对模板变异敏感度	较敏感	不敏感
5 copy灵敏度	开发难度大，判读困难	开发容易，判读容易
5 copy Ct值	通常>34	通常<28
DNA扩增用酶	Taq	SD 2.0
RNA扩增用酶	Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05	SD 3.0

三、TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术应用策略

在TaqMan One-Step Nested PCR的实验中，采用4条扩增引物的情况下，检测灵敏度和扩增速度较传统TaqMan PCR法会大幅提高。同时，由于采用了4条扩增引物，当在检测变异度较高的RNA病毒时，突变对扩增引物的影响显著降低，从而避免了漏检的可能性。当再增加一条检测探针时，对突变的敏感度进一步降低，此时已经与TaqMan PCR的双重检测防止漏检的设计完全相同，但One-Step Nested PCR法检测灵敏度更高。为了进一步提高检测灵敏度和扩增速度，可以再增加一对扩增引物，采用6引物进行扩增。

图3：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探针设计原理

四、TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针设计原则

表2 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物设计参数对比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物长度	18-26bp，条件完全相同
扩增引物TM值	55-60℃，条件完全相同（GC含量40-60%最佳
探针长度	20-35bp	20-28bp
探针TM值	一般68℃（>引物10℃）	一般63℃（>引物3-5℃）
扩增片段大小	<200bp	<300bp（外侧）
		<150bp（内侧）
探针位置	与引物3’端间隔2-6bp	与引物3’端间隔4-20bp

TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针目前还没有专用软件，可自行根据其它常用软件调整设计，或发送我处，由我处免费协助提供设计。

五、TaqMan One-Step Nested PCR的扩增性能展示

1.以非洲猪瘟DNA病毒核酸检测为例，进行TaqMan One-Step Nested PCR与TaqMan PCR两种方法性能的比较。


图4A：传统的TaqMan PCR法对10copy以下模板检测困难，通常Ct>35，不易判读。		图4B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，单copy分子Ct<30. 结果易于判读。

2.以2019-CoV RNA病毒核酸检测为例，应用TaqMan One-Step Nested PCR进行检测。

图5A:针对2019-CoV的N基因使用的引物、探针策略图示


图5B：2019-CoV的N基因靶标区段1（FAM通道）灵敏度测试		图5C：2019-CoV的N基因靶标区段2（HEX通道）灵敏度测试

3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或变异毒株的分型检测。

图6A:针对2019-CoV的S基因的D614G突变使用的引物、探针策略图示


图6B：2019-CoV病毒 D614G分型结果		图6C：2019-CoV病毒D614（野生型）灵敏度测试		图6D：2019-CoV病毒G614（突变型）灵敏度测试

六、常见问题

问题1： TaqMan One-Step Nested PCR是否可以做定量分析？
回答：由于采用巢式扩增系统，每个循环的倍增在2-4之间（在6引物系统中会更高），而不是传统PCR的2倍关系，因此不建议进行定量检测。但Nested PCR在不同的梯度模板中仍然表现出很好的浓度梯度关系，仍然可以通过Ct值判读模板的含量区间。

问题2：常规TaqMan探针能否代替Nested P-Bond探针？
回答：常规TaqMan探针对模板的绑定能力较P-Bond探针差很多，多数情况下切割效率低下，甚至不工作，因此不建议采用常规TaqMan探针。

问题3：每一条Nested P-Bond探针都能100%工作吗？
回答：由于未知的原因，目前还不能保证每条Nested P-Bond探针100%工作，有个别的探针切割效率低下、甚至无信号。总体来言，Nested P-Bond探针的成功率>80%。

问题4：怎样的设计才能达到单copy的检测水平？
回答：在采用6引物扩增系统中总能获得最高的检测灵敏度，但引物组合的筛选工作具有一定的挑战性。

问题5： TaqMan One-Step Nested PCR如何进行内参质控设计？
回答：在对内源内参进行扩增时，考虑到内源内参不需要很高的灵敏度，我们建议采用常规2条引物系统即可，通常内参扩增引物的使用浓度在100nM的浓度即可。内源内参通常采用ROX荧光标记。

问题6： TaqMan One-Step Nested PCR如何进行多靶基因设计？
回答：如果多靶基因设计的目标为，防止靶基因突变造成的脱靶（假阴性），那么通过在内侧引物区域内采用2条探针检测即可解决脱靶问题。如果多种病原单管检测的设计目标的话，由于使用的引物条数大幅增加，可参考MultiPlex设计方案对引物系统进行优化组合，这是具有一定挑战性的。

问题7：TaqMan One-Step Nested PCR可以进行直扩反应吗？
回答：SD 2.0 DNA Polymerase对杂质具有相当的耐受性，在DNA模板的检测中，可以采用粗制样品进行扩增。在DNA的检测中拭孖样本采用ddH2O浸泡后可以直接作为检测模板，拭孖样本的检测效果为最佳。血清、血浆样本对反应有一定的抑制作用，全血不能作为粗样本直接加入，稍后我们会给出详细的参数。由于SD 3.0 DNA/RNA Polymerase在反转录反应前，不能加热裂解样本，所以对RNA的模板检测来言，TaqMan One-Step Nested RT-PCR目前还不能进行粗样品的直接检测。现阶段，RNA粗制样本的直接检测请使用我处mTTx DNA/RNA聚合酶系统。

微信13903605303