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在核酸分子的恒温扩增过程中,无论采用LAMP、CPA等扩增技术,这种高速度的扩增特性,均不可避免的引起假阳性扩增。这种假阳性的扩增情况在LAMP扩增中表现尤为明显,由于LAMP扩增用到很高浓度的引物,因此难免保证有少量错配和引物Dimer,这些轻微的污染都会导致在LAMP高速扩增中造成假阳性。HaiGene优化的反应缓冲液,配合独有的显色技术和阴性控制技术建立的预混恒温mix系列产品,可高灵敏度、高特异性的用于LAMP pH变色、橙绿(OG)变色、HNB变色、SYBR Green荧光检测。在LAMP扩增实验中,与其它公司提供的LAMP Mix相比,得益于 Bst 4.0 DNA/RNA聚合酶的出色性能,HaiGene的 Bst 4.0 Mix具有更快的扩增速度和杂质耐受性。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Bst 4.0 MasterMix及冻干微球系列特点 |
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恒温扩增使用策略及实例展示 |
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1、Bst 4.0 Basic试剂 液体预混Bst 4.0 Basic Mix( A3824-02)和冻干球Bst 4.0 Basic Lyo Bead( A3828-02)试剂不包含任何显色染料,可自行搭配相关染料或检测手段进行LAMP反应,包括搭配OG染料管进行橙绿变色、搭配标记Oligo进行试纸条检测、搭配荧光染料进行荧光检测、搭配Molecular Beacon探针进行荧光检测等方法。 应用实例1: 在以A3824-02或 A3828-02搭配OG变色管( A3828-21)条件下,用 LP1002引物组进行COVID-19的LAMP测试。OG变色法为终点变色策略,在反应结束后,倒置反应管,溶解管盖上染料后,阳性样本呈现出醒目的绿色,阴性表现出橙色,区分明显。且该方法不受样本类型限制,杂质耐受性极佳。以2019-nCoV体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应20min后检测结果。 |
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2、Bst 4.0 Basic with UDG防污染试剂 LAMP是一种高速、高产核酸扩增法,通常会将目标产物放大10e10~12倍,微量的液体泄露和蒸发都可导致实验室污染,引起假阳性扩增。得益于HaiGene Bst4.0 DNA/RNA Pol识别dUTP底物的能力,使得防污染体系得以建立,并且维持了标准LAMP的扩增速度和灵敏度。HaiGene防污染恒温扩增试剂,在单管25 μl体系下,可以有效的去除十万copies(10e5)的污染物。本试剂可应用于荧光、核酸试纸条等核酸检测方法。 应用实例2: 以A3824-05为材料,加入荧光染料SYBR Green后,可用于荧光LAMP的检测。用 LP1004引物组进行COVID-19的污染物的LAMP测试,在采用防污染试剂后,10e5 copies污染模板无法检出。 |
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应用实例3:以A3824-05为材料,搭配核酸胶体金试纸条,用 LP1002修饰引物组(适用于核酸试纸条,HaiGene专有特异性控制技术)进行COVID-19的LAMP测试。以2019-nCoV体外转录RNA为模板,分别为10(阳性结果)、100(阳性结果)、1000 copies(阳性结果),NTC-ddH2O(阴性结果),10e5copies的dUTP污染物(阴性结果),65℃反应25min后点入试纸条。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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3、Bst 4.0 SYBR Green试剂 应用实例4:在以A3824-03或 A3828-03,用 LP1002引物组进行COVID-19的LAMP测试。Bst4.0 SYBR Green试剂可在标准定量PCR仪或恒温荧光仪上进行反应。以2019-nCoV体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6Copies,NTC为ddH2O为模板。下图为65℃反应25min的检测结果,可以看到检测反应<20min(达平台期)。 |
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4、Bst 4.0 LowSalt试剂 Bst 4.0 LowSalt试剂系列,包含极低浓度的缓冲盐。由于LAMP扩增中产生大量的H+导致反应完毕后的溶液pH由8.6-8.8下降到<7.2,因此可通过添加pH指示染料来进行样本的阳性扩增。 A3824-01和 A3828-01试剂中不含有任何染料,可用于自行添加染料,或用于其它pH检测系统的试剂开发。在搭配红色pH指示染料(A3828-23)的情况下,可进行红黄变色。 应用实例5:在以A3824-01或 A3828-01搭配红色pH指示染料(A3828-22)条件下, LAMP红黄变色反应用 LP1002引物组进行COVID-19的LAMP测试。以2019-nCoV体外转录RNA为模板,1-6分别为1、10、100、1000、10e4和10e6 Copies,NTC为ddH2O为模板。上图为加样结束反应起始前,下图为65℃反应30min 后。 |
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5、Bst 4.0 HNB试剂 Bst 4.0 HNB试剂中包含了HNB染料, 在LAMP扩增起始前HNB染料与Mg2+结合表现出肉眼可见的紫罗兰色,当阳性扩增发生时Mg2+被LAMP反应的副产物焦磷酸螯合,HNB染料无法与Mg2+结合表现出肉眼可见的天蓝色。由此判断天蓝色为阳性扩增。该显色方法受样本缓冲盐、pH等影响较小,适用的样本较pH显色法通用性更强。 应用实例6:在以A3824-04或 A3828-04,用 LP1002引物组进行COVID-19的LAMP测试。以2019-nCoV体外转录RNA为模板,分别为1000、100、10Copies/管(3重复)和NTC(3重复)。下图为65℃反应30min后检测结果。 |
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