HaiGene创新性技术平台----超敏TaqMan One-Step Nested PCR法|新海基因检测有限公司

HaiGene创新性技术平台----超敏TaqMan One-Step Nested PCR法

——————超越传统TaqMan PCR，卓越的灵敏度

产品编号	产品名称	规格	价格(元)
A2270	超敏巢式荧光PCR核酸检测试剂盒开发服务	套	询价
A2270-01	SD 2.0 DNA Polymerase	200T（25 µl 体系）	2,450
A2270-02	SD 3.0 DNA/RNA Polymerase	200T（25 µl 体系）	2,450
A2270-03	FAM Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-03	FAM Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-04	HEX Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-04	HEX Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-05	ROX Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-05	ROX Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A2270-05	Cy5 Nested P-Bond TaqMan Probe	1 OD×4	2,250
A2270-05	Cy5 Nested P-Bond TaqMan Probe	5 OD×8	询价
A227018	超敏双重非洲猪瘟巢式荧光PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	2,750
A227019	超敏新冠D614G分型巢式荧光RT-PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	5,500
A227018	超敏三重新冠巢式荧光RT-PCR检测盒 (TaqMan One-Step Nested PCR法)	100T（25 µl 体系）	3,750

一、TaqMan One-Step Nested PCR核酸扩增技术的原理

巢式PCR具有很高的灵敏度和特异性，但传统的巢式PCR采用两对引物，通过两轮PCR，进行目标产物的扩增。即，采用一对外侧引物进行第一轮扩增，之后再用一对内侧引物以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增。由于传统巢式PCR需要两步扩增，这种操作的不便性，使得其高灵敏度的特性难以应用到临床诊断中。在单管巢式PCR的扩增中，由于内侧引物会阻碍外侧引物的扩增，因此标准的Taq DNA聚合酶不能在单管巢式PCR的扩增中，发挥其高灵敏度的特性。仅有采用耐高温、且具有链置换活性的聚合酶（SD Polymerase），才能保证在单管反应中，内外两侧引物同时扩增，达到巢式PCR高灵敏的特性。
在标准PCR过程中，使用上游和下游两条引物对靶基因进行热循环扩增，每经过一个循环的扩增，产物最多变为2倍。而在One-Step Nested PCR(或称为PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的扩增中由于使用两条上游引物和两条下游引物，因此在每次热循环过程中，产物增加近4倍，在经过30-40次循环后，核酸产物将会高于PCR法成千上万倍，并且所需的循环数更少。在核酸检测的实验中，One-Step Nested PCR法比标准PCR法灵敏度要高10-100倍，并且更容易开发出高灵敏的检测试剂盒。

图1: One-Step Nested PCR工作流程的便利性		图2：One-Step Nested PCR法的高灵敏度原理

传统的巢式PCR采用2次PCR扩增，而One Step Nested PCR法单管一步完成，更利于使用。		标准PCR扩增，在一个热循环后，最多由1分子DNA变为2分子（倍增为2n，n=循环数）。而在采用4引物的One-Step Nested PCR扩增反应中，每经过一次热循环扩增，最多由1分子DNA变为4分子（倍增为4n）。

二、HaiGene的TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术

一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技术最早报道于2013年，虽然其拥有高灵敏度的检测特性，但始终未能在核酸检测领域获得广泛应用。其主要原因是SD聚合酶的链置换活性过于强烈，而导致外切酶活性作用的机会太弱，导致高信噪比的TaqMan探针无法应用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的荧光探针检测只能依靠特异性和信噪比欠佳的发卡FRET探针。HaiGene凭借在分子工具酶改造工作中积累的的丰富经验，开发出具有探针切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，结合独有的P-Bond锚定探针技术，将高信噪比的TaqMan探针应用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested PCR方法。运用TaqMan One-Step Nested PCR方法检测DNA或RNA分子，在检测灵敏度和扩增速度方面，都是传统TaqMan PCR法难以企及的。对于下游用户来讲，TaqMan One-Step Nested PCR在试剂配制、反应程序、所需设备等各个方面，几乎完全一致，不存在任何操作变化的屏障。因此，不论对于实力强劲的大型基因公司继续巩固现有市场，还是对于起步发展阶段的中小型基因公司抢占市场份额，TaqMan One-Step Nested PCR技术都将是未来基因检测市场争夺战中的最有利武器。

表1 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能对比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物数	两条	四条或六条
探针	双标荧光探针	双标P-Bond荧光探针
热循环倍增数	<2	>2
扩增条件	热变性循环	热变性循环
检测设备	标准定量PCR仪	标准定量PCR仪
数据判读方式	扩增曲线或Ct值	扩增曲线或Ct值
对模板变异敏感度	较敏感	不敏感
5 copy灵敏度	开发难度大，判读困难	开发容易，判读容易
5 copy Ct值	通常>34	通常<28
DNA扩增用酶	Taq	SD 2.0
RNA扩增用酶	Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05	SD 3.0

三、TaqMan One-Step Nested PCR荧光法核酸检测技术应用策略

在TaqMan One-Step Nested PCR的实验中，采用4条扩增引物的情况下，检测灵敏度和扩增速度较传统TaqMan PCR法会大幅提高。同时，由于采用了4条扩增引物，当在检测变异度较高的RNA病毒时，突变对扩增引物的影响显著降低，从而避免了漏检的可能性。当再增加一条检测探针时，对突变的敏感度进一步降低，此时已经与TaqMan PCR的双重检测防止漏检的设计完全相同，但One-Step Nested PCR法检测灵敏度更高。为了进一步提高检测灵敏度和扩增速度，可以再增加一对扩增引物，采用6引物进行扩增。

图3：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探针设计原理

四、TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针设计原则

表2 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物设计参数对比
	TaqMan PCR	TaqMan One-Step Nested PCR
扩增引物长度	18-26bp，条件完全相同
扩增引物TM值	55-60℃，条件完全相同（GC含量40-60%最佳
探针长度	20-35bp	20-28bp
探针TM值	一般68℃（>引物10℃）	一般63℃（>引物3-5℃）
扩增片段大小	<200bp	<300bp（外侧）
		<150bp（内侧）
探针位置	与引物3’端间隔2-6bp	与引物3’端间隔4-20bp

TaqMan One-Step Nested PCR的引物和探针目前还没有专用软件，可自行根据其它常用软件调整设计，或发送我处，由我处免费协助提供设计。

五、TaqMan One-Step Nested PCR的扩增性能展示

1.以非洲猪瘟DNA病毒核酸检测为例，进行TaqMan One-Step Nested PCR与TaqMan PCR两种方法性能的比较。


图4A：传统的TaqMan PCR法对10copy以下模板检测困难，通常Ct>35，不易判读。		图4B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，单copy分子Ct<30. 结果易于判读。

2.以2019-CoV RNA病毒核酸检测为例，应用TaqMan One-Step Nested PCR进行检测。

图5A:针对2019-CoV的N基因使用的引物、探针策略图示


图5B：2019-CoV的N基因靶标区段1（FAM通道）灵敏度测试		图5C：2019-CoV的N基因靶标区段2（HEX通道）灵敏度测试

3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或变异毒株的分型检测。

图6A:针对2019-CoV的S基因的D614G突变使用的引物、探针策略图示


图6B：2019-CoV病毒 D614G分型结果		图6C：2019-CoV病毒D614（野生型）灵敏度测试		图6D：2019-CoV病毒G614（突变型）灵敏度测试

六、常见问题

问题1： TaqMan One-Step Nested PCR是否可以做定量分析？
回答：由于采用巢式扩增系统，每个循环的倍增在2-4之间（在6引物系统中会更高），而不是传统PCR的2倍关系，因此不建议进行定量检测。但Nested PCR在不同的梯度模板中仍然表现出很好的浓度梯度关系，仍然可以通过Ct值判读模板的含量区间。

问题2：常规TaqMan探针能否代替Nested P-Bond探针？
回答：常规TaqMan探针对模板的绑定能力较P-Bond探针差很多，多数情况下切割效率低下，甚至不工作，因此不建议采用常规TaqMan探针。

问题3：每一条Nested P-Bond探针都能100%工作吗？
回答：由于未知的原因，目前还不能保证每条Nested P-Bond探针100%工作，有个别的探针切割效率低下、甚至无信号。总体来言，Nested P-Bond探针的成功率>80%。

问题4：怎样的设计才能达到单copy的检测水平？
回答：在采用6引物扩增系统中总能获得最高的检测灵敏度，但引物组合的筛选工作具有一定的挑战性。

问题5： TaqMan One-Step Nested PCR如何进行内参质控设计？
回答：在对内源内参进行扩增时，考虑到内源内参不需要很高的灵敏度，我们建议采用常规2条引物系统即可，通常内参扩增引物的使用浓度在100nM的浓度即可。内源内参通常采用ROX荧光标记。

问题6： TaqMan One-Step Nested PCR如何进行多靶基因设计？
回答：如果多靶基因设计的目标为，防止靶基因突变造成的脱靶（假阴性），那么通过在内侧引物区域内采用2条探针检测即可解决脱靶问题。如果多种病原单管检测的设计目标的话，由于使用的引物条数大幅增加，可参考MultiPlex设计方案对引物系统进行优化组合，这是具有一定挑战性的。

问题7：TaqMan One-Step Nested PCR可以进行直扩反应吗？
回答：SD 2.0 DNA Polymerase对杂质具有相当的耐受性，在DNA模板的检测中，可以采用粗制样品进行扩增。在DNA的检测中拭子样本采用ddH₂O浸泡后可以直接作为检测模板，拭子样本的检测效果为最佳。血清、血浆样本对反应有一定的抑制作用，全血不能作为粗样本直接加入，稍后我们会给出详细的参数。由于SD 3.0 DNA/RNA Polymerase在反转录反应前，不能加热裂解样本，所以对RNA的模板检测来言，TaqMan One-Step Nested RT-PCR目前还不能进行粗样品的直接检测。现阶段，RNA粗制样本的直接检测请使用我处mTTx DNA/RNA聚合酶系统。

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