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Gibson无缝连接试剂盒

产品编号 产品名称 规格 价格(元) 说明书
D2601 Gibson无缝连接试剂盒 10T/50T 600/2,000
Gibson无缝连接试剂盒是一种混合酶系统,其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多个PCR片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA连接酶,不受载体和目的片段的酶切位点限制,可在30分钟内实现PCR片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置,从而获得完整的双链DNA分子。该试剂盒使用简单,只需加入合适比例的载体和PCR片段在50℃孵育15-30min即可完成片段的连接。

优势

  • 不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆
  • 不依赖于T4连接酶,高效连接,无碱基缺失
  • 可同时高效连接一个或多个PCR片段
  • 无需额外的亚克隆,菌检阳性率高达95%
  • 原理

  • T5外切酶可从双链DNA5'端切割形成3'突出末端, 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。
  • G5 高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3'端延伸,从而填补片段缺口。
  • Taq DNA连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA分子。
  • Gibson无缝克隆试剂盒

    组分

    组分名称 10T 50T
    2XGibson Assemble Mix 50μl 250μl

    储存

    20℃可保存2年,-80℃可保存5年,避免反复冻融。

    检测效果和应用实例

    1. KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体,插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因(966bp),然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32,50℃孵育15min,然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞,涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比,A为对照(不加片段)B为实验组(Gp32片段),右图为挑取32个斑进行PCR扩增后电泳,其中阳性检出率为31/32(~97%)。
    2.PCR 扩增pCold-sumo-M vector获得线性化载体,插入与载体有15nt同源臂的引物扩增Bst基因(2.4kb),然后应用2xGiboson Assembly Mix连接线性化载体和Gp32,50℃孵育30min,然后取5μl连接产物转化DH5a感受态细胞,涂板过夜后菌检。其中左图为长斑情况对比,A为对照(不加片段)B为实验组(Gp32片段),右图为挑取40个斑进行PCR扩增后电泳,其中阳性检出率为40/40(~100%)。
    3. KpnI/HindIII酶切pCold-sumo-M vector获得线性化载体,插入与载体有25nt同源臂的引物扩增Gp32基因(966bp),加入的载体与片段的摩尔比分别是1:1、1:2、1:3的长斑情况对比,其中1:3时长斑数量最多,三者菌检阳性率无显著差异。